سرزمین زیست شناسی

محيط هاي کشت را  از نظر قوام به سه گروه تقسيم مي کنيم:

اولين گروه مايع هستند که براث ناميده مي شوند مانند نوترين براث- مولر هينتون براث

در اين نوع محيط هاي کشت که به صورت سوسپانسيون هستند حرکت ديده نمي شود. 

دومين گروه جامد هستند که آگار ناميده مي شوند مانند نوترين آگار- مولر هينتون آگار

سومين گروه محيط کشت هاي نيمه جامد هستند که مقدار آگار آن ها نسبت به محيط جامد کمتر است    تا5% آگار دارند). 

اين نوع محيط هاي کشت زماني استفاده مي شوند که بخواهيم حرکت باکتري ها را مشاهده کنيم. 

انواع محيط هاي کشت:  

ساده :دراين محيط ها باکتري هايي رشد مي کنند که نياز غذايي حداقل دارند .مثلاً در نوترين، استاف رشد مي کند.

غني شده: باکتري هايي رشد مي کنند که نيازبه  غذاهاي مقوي تر دارند. براي غني کردن روي محيط پايه، مواد غذايي ديگري اضافه مي کنيم .مثل محيط کشت بلاد آگار(خون افزوده مي شود)

اختصاصي : در اين نوع از محيط هاي کشت موادي (مثلا آنتي بيوتيک خاص، رنگ ، املاح صفراوي و...) وجود دارد تا مانع رشد برخي از باکتري ها شود وآن را براي رشد گروه خاصي از باکتري ها مختص نمايد. به طور مثال: 

استرپ مي تواند در محيط کشت بلاد آگار که با کريستال ويوله اختصاصي شده رشد کندولي استاف نمي تواند رشد نمايد.

اشرشيا کلاي چون گرم منفي است مي توان در محيط کشت    EMB(ائوزين متيلن بلو) آن را از بقيه گروه هاي باکتري ها جدا کرد ، چون مي تواند در EMB رشد کند.

افتراقي: باکتري هايي که در اين محيط کشت رشد مي کنند را مي توان از نظر برخي مشخصات از هم تفکيک نمود. 

مثلاً EMB در عين حال که محيط کشت اختصاصي جهت باکتري هاي گرم منفي است محيط کشت افتراقي نيزمي باشد.در  اين محيط باکتري هاي گرم منفي لاکتوز مثبت مانند اشرشيا کلاي، کلني رنگي و باکتري هاي گرم منفي لاکتوز منفي ، کلني شفاف ايجاد مي کنند.

انواع ديگري ازمحيط هاي کشت نيز وجود دارد مانند: محيط کشت غني کننده ، محيط کشت ترانسپورت و...

آماده سازي  واستريل کردن محيط هاي کشت ميکروبي

معمولاً مواد محيط هاي کشت مختلف به صورت پودر هاي آماده در ظروفي به طور تجاري تهيه شده اند وقابل خريداري ودر دسترس مي باشند. فرمولاسيون ونحوه آماده سازي هر محيط کشت  بر روي برچسب ظروف مربوطه نوشته شده است.

در اين جا به عنوان نمونه، به نحوه آماده سازي محيط کشت نوترين آگار مي پردازيم.

* نحوه آماده سازي محيط کشت N. A (نوترين آگار):

8/2گرم ماده نوترين آگار را در 100سي سي آب مقطر حل کرده ودر ارلن استريل مي ريزيم. معمولاً حجم ارلن بايد دوبرابر حجم محلول محيط کشت باشد که در زمان حرارت وبه جوش آمدن، سرريز نگردد. آگار در 94 درجه سانتي گراد حل مي شود، پس براي انحلال کامل آن بايد محلول را تا حد جوشيدن حرارت دهيم. بهترين روش براي جلوگيري از ته گرفتن محيط کشت وانحلال بهينه، قرار دادن آن در بن ماري جوش است. حرارت دادن بايد تا شفاف شدن کامل محلول ادامه يابد. پس از آن درب ارلن رابا فويل آلومينيومي يا پنبه يا گاز استريل مسدود مي نماييم وجهت استريل کردن کامل، ارلن را در اتوکلاو قرار مي دهيم.

(اگر محيط کشت براث (مايع) بود بايستي محلول را مستقيماً در لوله آزمايش ريخته، درب آنها را با پنبه استريل مسدود ودر اتوکلاو قرار دهيم.)

ارلن محتوي محيط کشت شفاف شده رادر اتوکلاو در دماي 121 درجه درفشار15پوند(2اتمسفر) به مدت15 الي 20 دقيقه قرارداده وقتي دما به50 درجه رسيد آن را از اتوکلاوخارج مي نماييم در کنار شعله به پليت هاي استريل انتقال مي دهيم به طوري که حدوددوسوم حجم پليت را پرکند وبلافاصله درب پليت ها را مي بنديم.پس از جامد شدن محيط کشت که چند دقيقه اي طول مي کشد ، محيط مذکور جهت انتقال ميکروب ها وکشت آنها آماده است.

*اجراي تکنيک رنگ آميزي گرم 

براي انجام اين بخش از فعاليت ها از دونمونه کشت يافته اشرشيا کلاي (نمونه اي از باکتري هاي گرم منفي ) واستافيلوکوکوس اورئوس (نمونه اي از باکتري هاي گرم مثبت ) استفاده شد. 

مراحل کار به ترتيب:

1- استريل کردن لوپ روي شعله2- برداشتن نمونه با لوپ3- گسترش روي يک لام تميز 4- فيکس کردن کنار شعله 5- افزودن کريستال ويوله به مدت يک دقيقه 6- شستشو با آب مقطر 7- افزودن لوگول به مدت يک دقيقه

8- شستشو با آب مقطر 9- افزودن الکل استن به مدت 10-15 ثانيه 10- شستشو با آب مقطر 11- افزودن سافرانين (يا فوشين) به مدت 30-45 ثانيه 12- شستشو با آب مقطر، خشک کردن ومشاهده در زير ميکروسکوپ(پس از رنگ آميزي گرم باکتري هاي گرم مثبت به رنگ بنفش يا آبي و باکتري هاي گرم منفي به رنگ قرمز يا صورتي مشاهده مي شوند.)